2023年7月发表在Cell Death & Disease（IF 9.0）的文章《UBE2S interacting with TRIM21 mediates the K11-linked ubiquitination of LPP to promote the lymphatic metastasis of bladder cancer》，该篇文章使用了珀罗汀无细胞蛋白质表达试剂盒合成泛素-K11R蛋白，深入探究泛素化在膀胱癌淋巴转移中的作用机制。本文利用无细胞表达技术实现更高效、快速、灵活的合成重组蛋白，大大降低实验周期和人力成本。
 

研究背景

膀胱癌（BCa）是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，2020年全球报告了573,000例新诊断病例和213,000例死亡病例。其中淋巴转移是膀胱癌（BCa）转移中最常见的模式，预后极差。尽管已经使用了一些新的尿液分析法和治疗药物，但肌肉侵入性BCa（MIBC）预后仍然很差。据报道，在各类癌症中泛素结合酶E2S（UBE2S）的表达均表现出上调，并与预后不良相关。然而，UBE2S在BCa淋巴转移中的生物学机制仍有待发现。

本研究旨在说明UBE2S与TRIM21（三元基序家族成员）的相互作用，并发现通过K11相关泛素化降解LPP（脂肪瘤伴侣）会促进BCa的淋巴转移。证明了UBE2S是转移性BCa的有力的治疗靶点。队列设置

队列1：包括210个BCa组织标本和59个正常尿路上皮组织；
队列2：由59个成对的微阵列组织组成；
组学数据：TCGA和GEO（GSE48277，GSE120736和GSE31684）；
此外，作者从MSigDB下载Ubiquitination相关基因（KEGG UBIQUITIN MEDIATED PROTEOLYSIS）。

研究结果

1.UBE2S与淋巴转移和BCa预后不良呈正相关
研究人员对TCGA-BLCA数据库进行了生物信息学分析，确定了BCa淋巴转移中的关键泛素酶。此外，通过差异表达分析确认了UBE2S是TCGA-BLCA中与泛素化以及转移相关的高表达基因。随后，研究人员使用IHC检测，在队列1中检测到UBE2S蛋白质水平，发现UBE2S位于核和细胞质中，而NAT中几乎没有，并呈现出从非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）到肌肉浸润性膀胱癌（MIBC），无淋巴转移的MIBC（LN-MIBC）到淋巴转移的MIBC（LN+ MIBC）逐步增加的趋势。与TCGA数据库中的NAT相比，BCa组织中的UBE2S高表达率一致（图1E）。研究人员对不同队列以及数据库信息进行了对比（图1F-P），并进行Kaplan‒Meier生存（图1Q-1R），发现UBE2S高表达是BCA患者OS和DFS的风险因素。结果表明UBE2S的高表达不仅与淋巴转移、肿瘤晚期和组织学等级有关，还能预测BCA患者的预后不良。
 

图1：UBE2S与膀胱癌（BCa）的淋巴转移和预后不良呈正相关

2.UBE2S敲低抑制BCa体外迁移和入侵以及体内淋巴转移
作者使用T24和UM-UC-3细胞系构建了稳定的UBE2S-knockdown 和 UBE2S-overexpressing模型。伤口愈合和transwell迁移分析显示，UBE2S敲低组的迁移速度和BCa细胞数量大幅下降（图2B，C），且当UBE2S被沉默时，BCa细胞的入侵能力被显著抑制（图2D），但当UBE2S过表达后会增强。使用稳定的UBE2S-knockdown UM-UC-3细胞建立了体内popliteal LN模型（图2E），与对照组相比，UBE2S-knockdown组观察到politeal LNs的发光显著下降。UBE2S沉默也明显减少了popliteal LNs的体积。同时，基于Popliteal LNs的H&E染色表明，UBE2S敲低组淋巴结转移百分比从匹配组的100%减少到20%（图2J，K）。总而言之，UBE2S增加了BCa细胞体外的迁移和入侵以及体内淋巴转移。

图2：UBE2S敲低抑制BCa体外迁移和入侵以及体内淋巴转移

3.UBE2S在BCa的细胞核和细胞质中与TRIM21和LPP相互作用
研究人员对带有UBE2S抗体的野生型T24和UM-UC-3细胞进行了免疫沉淀和质谱分析，发现了10种E3酶，其中TRIM21、UBR5和UBE3C被报道与肿瘤转移有关。此外，还选择了另外三个转移相关基因（TRIP13、LPP和PRMT1）用于对UBE2S 27个潜在底物蛋白进一步研究。最后，通过co-IP和western blot分析确认了UBE2S、TRIM21和LPP之间的相互作用（图3A），进一步的免疫荧光分析显示，UBE2S、TRIM21和LPP在BCa细胞核和细胞质中高度共定位（图3B）。此外，LPP蛋白在UBE2S-敲低的 BCa细胞中白表达增加，但在UBE2S过表达细胞中减少，但是TRIM21表达不受影响（图3C）。TRIM21敲低增加了LPP蛋白表达水平（图3D）。后续的qPCR分析发现UBE2S和TRIM21的敲低没有明显增加LPP的mRNA水平，表明UBE2S和TRIM21主要通过翻译后修改来调节LPP。

图3：UBE2S在BCa的细胞核以及细胞质中与TRIM21和LPP相互作用。

4.UBE2S与TRIM21相互作用，通过K11连接的泛素化降解LPP
研究人员用MG132（一种蛋白酶体抑制剂）治疗后，LPP蛋白水平的差异显著减弱，表明UBE2S是通过泛素化介导了LPP降解。接着研究人员在HEK293T细胞中进行了体内泛素化分析，此外，使用珀罗汀无细胞蛋白合成试剂盒合成泛素-K11R蛋白进行体外泛素化分析。结果表明UBE2S与TRIM21相结合，在LPP上介导了K11链接的形成。进一步，作者构建了一个缺乏环域（ΔRING）的TRIM21质粒（图4I），证实了TRIM21的RING结构域是LPP泛素化所必需的。
 

图4：UBE2S与TRIM21相互作用，通过诱导K11连锁泛素化来降解LPP

5.LPP抑制UBE2S对BCa的转移效应
研究人员在队列2中进行了IHC检测，在UBE2S和LPP的表达之间观察到显著的负相关性（图5A，B）；卡方测试表明，LPP表达与N和M疾病分期呈负相关。且LPP表达从NAT、LN-CA到LN + CA中呈现依次调的趋势（图5C）。对队列2进行Kaplan‒Meier生存分析，发现LPP表达低的BCa患者预后不佳，OS和DFS率较低（图5E，F）。此外，单变量和多变量分析均表明，低LPP表达是BCA患者OS和DFS的风险因素。然后，研究了UBE2S是否通过转染siRNA以LPP依赖的方式发挥致癌功能（图5G）。结果表明LPP沉默明显增加了BCa细胞的迁移和入侵（图5H-J）。因此，LPP在BCa中起到肿瘤抑制剂的作用，并逆转了UBE2S的转移促进作用。

图5：LPP逆转了UBE2S的转移促进效应

6.UBE2S以LPP依赖的方式促进BCa细胞的EMT

接下来，作者通过western blot检测EMT标志物的表达。结果表明UBE2S通过促进EMT过程增强了BCa细胞的转移（图6A）。此外，LPP敲低增加了间充质标志物的蛋白水平，但会降低BCa细胞中的上皮标志物蛋白水平（图6B）。免疫荧光染色表明，沉默UBE2S削弱了EMT，而过表达UBE2S加速了EMT（图6C）。此外，使用IHC分析从UBE2S-knockdown体内模型中得出的肿瘤组织中检测到EMT标记物（图6D）。在抑制LPP后，UBE2S敲低使得EMT的抑制显著恢复（6E）。这些数据验证了UBE2S是以LPP依赖的方式促进了BCa细胞中的EMT。

图6：UBE2S以LPP依赖的方式促进BCa细胞中的EMT

7.Cephalomannine (三尖杉宁碱)在药理学上抑制UBE2S并阻止BCa细胞的淋巴转移

接着作者探究了Cephalomannine（一种抑制UBE2S启动子活性的小分子化合物）的功能作用。在用Cephalomannine 处理的BCa细胞中，UBE2S的表达以剂量依赖性方式逐渐降低（图7A）。Transwell迁移和入侵分析显示Cephalomannine 对BCa细胞有很强的抑制作用（图7B，C）。淋巴转移的模型显示，Cephalomannine 治疗组的相对发光和popliteal LN 体积都以剂量依赖的方式明显下降（图7D、H）。此外，IHC对肿瘤组织的检测显示，Cephalomannine 降低了UBE2S、 N-cadherin, vimentin 和 Ki-67 的表达，但以浓度依赖性的方式增加了LPP和 N-cadherin的表达（图7K）。血液分析显示Cephalomannine 没有明显的毒性。这些数据证明Cephalomannine 通过靶向UBE2S，在体外和体内都抑制了BCa细胞转移。

图7：Cephalomannine在药理学上抑制UBE2S并阻断BCa细胞的淋巴转移

8.Cephalomannine抑制了人类BCa衍生类器官的生长和转移
为了深入研究Cephalomannine在BCa中的临床价值，作者建立了四种患者源性类器官（PDOs）（图8A）。在功能上，表明了Cephalomannine以剂量依赖的方式干扰了BCa类器官的生长和增殖（图8B，C）。且BCa类器官对Cephalomannine的敏感性明显更高（图8D）。此外，还发现Cephalomannine降低了间充质标志物N-cadherin的表达，表明Cephalomannine阻断了BCa类器官中的EMT（图8E）。

图7：Cephalomannine抑制来自人类BCa的类器官的生长和转移

结论
本研究发现了一种新的生物标志物和治疗靶点UBE2S。为UBE2S在BCa淋巴转移中的关键作用提供了证据，接着研究了UBE2S-TRIM21-LPP轴作为一种新型蛋白酶体介导的机制，发现UBE2S与TRIM21直接相互作用。并使用珀罗汀的无细胞蛋白表达试剂盒合成泛素-K11R蛋白进一步研究泛素化的作用机制，确定了UBE2S诱导的LPP下调是以泛素‒蛋白酶体依赖的方式发生。K11连接的Cephalomannine通过降解LPP来增强BCa细胞的转移能力和EMT，抑制人类BCa衍生类器官的增值和转移。并且不会出现明显的毒性。

 

发表文献
Xiao K, Peng S, Lu J, Zhou T, Hong X, Chen S, Liu G, Li H, Huang J, Chen X, Lin T. UBE2S interacting with TRIM21 mediates the K11-linked ubiquitination of LPP to promote the lymphatic metastasis of bladder cancer. Cell Death Dis. 2023 Jul 8;14(7):408. doi: 10.1038/s41419-023-05938-2. PMID: 37422473; PMCID: PMC10329682.